GFP dalam Studi Ekspresi Gen

GFP atau Green Fluorescent Protein adalah protein yang dapat berpendar yang secara alami dihasilkan oleh ubur-ubur. GFP kini digunakan secara luas dalam studi-studi ekspresi gen maupun mikroskopik karena aplikasinya yang relatif mudah. Hanya dengan adanya pendaran cahaya dapat menunjukkan bahwa gen yang kita teliti terekspresi. Hmm, bagaimana bisa?

Dalam artikel terdahulu telah disebutkan bahwa sang ubur-ubur atau Jellyfish telah menghantarkan 3 peneliti meraih hadiah Nobel bidang kimia tahun 2008. Mereka adalah Oshamu Shimomura yang memurnikan GFP dan mendeskripsikan sifat biofisik serta proses berpendarnya GFP, lalu Martin Chalfie yang beberapa tahun kemudian melaporkan keberhasilannya mengekspresikan gen GFP di dalam sel E. coli dan C. elegans, serta Roger Tsien yang berhasil memodifikasi warna pendaran hijau GFP menjadi bermacam warna yaitu cyan, biru dan kuning dengan cara mengubah satu asam amino pada GFP. Atas jasa mereka kini para peneliti sangat terbantu dalam melakukan studi ekspresi genetik.

Roger Tsien berhasil membuat GFP ubur-ubur berwarna-warni (image from scienceboard.net)

GFP menjadi istimewa karena ia bersifat auto-katalitik, tidak membutuhkan kofaktor atau enzim lain agar ia bekerja. Selain itu GFP dapat digabung (fusi) dengan protein lain tanpa saling mengganggu fungsi masing-masing. Sehingga GFP dapat digunakan secara luas di berbagai organisme.

Pendaran GFP dapat diamati secara visual dengan bantuan mikroskop. Berikut ini beberapa teknik dalam aplikasi GFP.

Fusi Translasi

Teknik pertama dikenal dengan fusi translasi, dimana ORF (Open Reading Frame) GFP diklon di belakang ORF gen yang akan kita amati, sehingga nanti akan ditranslasi menjadi sebuah protein gabungan yang panjang. Jadi jika kita melihat pendaran GFP maka berarti protein yang kita amati pun terekspresi di situ. Cahaya fluorescent GFP dapat diamati dalam bentuk gambar diam maupun bergerak sehingga kita dapat mengetahui lokasi dan pergerakan protein di dalam sel.

Fusi Transkripsi

Teknik kedua disebut fusi transkripsi dimana ekspresi gen yang kita amati dan GFP digerakkan melalui promoter yang sama tetapi antara kedua gen tersebut diselingi oleh stop kodon, jadi ekspresinya berbarengan namun tetap menghasilkan dua protein terpisah. Dalam hal ini sel yang mengekspresikan gen pertama akan dipenuhi oleh GFP yang larut sehingga berpendar, dan bisa mendeteksi sel mana yang mengekspresikannya.

FLIP dan FRAP

Sel yang mengekspresikan GFP (image from bumc.bu.edu)

Kita tahu bahwa suatu molekul mengemisikan cahaya fluorescent ketika ia tereksitasi, namun kondisi ini tidak berlangsung selamanya, dalam jangka waktu tertentu cahayanya akan redup dan padam. Nah, FLIP dan FRAP ini digunakan untuk mempelajari dinamika protein yang terlabel GFP. Caranya dengan bleach-out(memadamkan) daerah tertentu pada sel, kemudian dilihat berapa lama waktu yang diperlukan oleh protein terlabel protein untuk “merembes” kembali ke area gelap tadi, teknik ini yang disebut FRAP (Fluorescent Recovery After Photobleaching). Kita juga dapat mengamati seberapa besar penurunan intensitas fluorescent secara keseluruhan di bagian sel yang lain ketika protein yang sudah diphotobleach tadi terdifusi, atau disebut FLIP (Fluorescent Loss in Photobleaching).

FRET

FRET atau fluorescence resonance energy transfer sudah banyak diaplikasikan dalam beberapa teknik seperti Real Time PCR. Prinsipnya yaitu dengan memanfaatkan dua buah fluophore (zat yang dapat berfluorescent) yang mana fluorophore pertama memiliki spektrum emisi yang tumpang tindih dengan spektrum eksitasi fluorophore kedua. Jadi ketika fluorophore pertama memancarkan cahaya fluorescent, otomatis yang kedua pun akan tereksitasi dan memancarkan fluorescent. Dalam aplikasinya, dua buah protein dilabel dengan dua macam GFP yang memenuhi kriteria FRET tadi. Kemudian sel ditembak dengan laser yang dapat mengeksitasi hanya fluorophore pertama. Dengan demikian jika protein kedua ada dekat dengan protein pertama, otomatis akan terdeteksi juga karena memancarkan cahaya yang berbeda.

Bagaimana, apakah Anda pernah mempunyai pengalaman riset dengan GFP?

 sumber: http://setiyoprajoko.blogspot.com/2013/04/gfp-dalam-studi-ekspresi-gen.html