Studi Kasus Enzim dari sumber bahan hayati laut

Studi Kasus Enzim dari sumber bahan hayati laut

Judul Jurnal : “Isolasi dan Identifikasi Bahan Aktif Penyebab Pemancaran Cahaya Pada Bakteri Photobacterium Phosphoreum yang Diisolasi Dari Cumi Laut Jepara Indonesia”

Penulis         : Ratnawulan, Delianis Pringgenis, dan Idam Arif.

Resume

Tujuan penelitian mengenai isolasi dan identifikasi bahan aktif penyebab cahaya pada bakteri Photobacterium Phosphoreum yang diisolasi dari cumi laut Jepara Indonesia adalah untuk menyelidiki proses pemancarannya. Pada jurnal tersebut enzim yang dibahas adalah enzim yang dinamakan luciferase yang dihasilkan dari hasil hubungan simbiosa antara cumi-cumi jenis Laligo duvaucelli dengan bakteri Photobacterium Phosphoreum yang hidup di dalamnya. Dimana enzim Luciferase tersebut dapat memancarkan cahaya pada bakteri luminisensinya karena sifat dari enzim ini dapat mengkatalis tiga substrat yaitu flavin mononukleotida tereduksi (FMNH2), molekul oksigen (O2) dan aldehyde rantai panjang (RCOH). Reaksi tersebut membbaskan flavin (FMN), asam lemak rantai panjang (RCOOH) , molekul air (H2O) sambil memancarkan cahaya tampak (hv).

Fenomena bioluminisensi pada bakteri Photobacterium Phophoreum ini dikaji dikarenakan sebagai contoh nanofabrikasi fotonik alamiah yang akan menjadi inspirasi penelitian peralatan optic dan spektroskopik di masa akan datang, untuk monitoring konsentrasi racun di alam dan alat uji yang bioluminisensi yang memakai enzim merupakan pendekatan baru  dalam monitoring lingkungan. Selain itu ketersedian bahan baku yang sanagnt melimpah di perairan Indonesia juga menjadi alasan untuk melakukan isolasi, identifikasi dan karakterisik sifat-sifat fisika dari bahan aktif penyebab pemancaran cahaya pada bakteri Photobacterium Phosphoreum tersebut.

Teknik Isolasi enzim

Isolasi merupakan suatu proses atau cara  untuk memisahkan dan memindahkan mikroba/enzim tertentu dari lingkungannya, sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni. Kultur murni adalah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan satu sel tunggal yang sangat berguna untuk menelaah dan mengindentifikasi mikroorganisme.

Dalam teknik isolasi pada bakteri Photobacterium Phosphoreum diisolasi dari cumi spesifik Indonesia jenis Loligo duvacelli yang dapat dikultur pada medium padat yang terdiri dari 3 g extract Bacto, 5 g peptone-bacto, 15 g agar bacto, 30 g NaCl, 3 ml glycerol kemudian 1 liter air suling dan NaOH secukupnya setelah itu dilanjutkan pada 5 liter medium cair yang terdiri dari 1 liter air suling; 30 g NaCl, 14 g Na2HPO4.7H2O, 2 g KH2PO4, 0,5 g (NH4)2HPO4, 0,2 g MgSO4.7H2O, 3 ml glyserol, 5 g triptone bacto, 5 g ekstrak ragi bacto dan NaOH secukupnya untuk mengatur pH 7.0. untk proses pertumbuhannya dapat diukur secara langsung dengan dengan spektrofotometer. Kemudian bakteri-bakteri diinkubasi pada suhu kamar selama 24 jam hingga terbentuk koloni tunggal yang nantinya akan diinkubasi kembali ke dalam 100 ml media cair selama 20 jam dengan kecepatan 200 rpm. Seiring berjalannya inkubasi secara bersamaan dilakukan sampling pengukuran waktu dimana hasil sampling tersebut ditentukan dengan spektrofotometer UV-Vis (Ultraviolet-Visible) pada panjang gelombang 660nm. Sel dipanen pada kerapatan sel 4×10-9 sel/ml. sampel hasil sampling, disentrifugasi dengan kecepatan putar 6000 rpm selama 30 menit pada suhu 4 0C, agar cairan fermentasi dan supernatannya terpisah. Supernatan dicuci dengan air suling dingin sebanyak tiga kali untuk menghilangkan sisa-sisa media dan sel-sel yang mati. Setiap kali pencucian, dilakukan sentrifugasi dan penimbangan untuk mengetahui berat molekul supernatan yang tertinggal. Kemudian supernatant tersebut disuspensi dalam larutan buffer fosfat 0,05 M pH 7 (sebanyak 1 gram sel basah dalam 5 ml buffer fosfat). Supernatan yang telah disuspensi tersebut dipecah dengan alat sonikasi selama 5 menit dalam keadaan dingin sebanyak 5 kali. Hasil sonikasi diinkubasi kembali selama 1 jam, yang selanjutnya disentrifugasi selama 20 menit pada kecepatan putar 12000 rpm pada 40C. Ekstrak kasar yang diperoleh ditentukan aktivitas dan konsentrasi proteinnya. Setelah itu kemudian mengendapkan protein  yang ada di sample tadi dengan melakukan fraksionasi ammonium sulfat dengan derajat 25-85 %. Penambahan ammonium sulfat dilakukan sambil mengaduk-aduk larutan ekstrak kasar secara perlahan dengan pengaduk magnet pada suhu 4 0C, diamkan selama satu malam agar sempurna pengendapannya dan untuk pemisahan endpan dengan supernatant dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan putar 7000 rpm selama 30 menit. Supernatan yang diperoleh ditentukan aktivitas dan konsentrasi proteinnya. Hasil isolasi menggunakan BSA menunjukkan dua pita pada enzim Luciferase pada bakteri Photobacterium Phosphoreum  yang merupakan dua sub unit α dan β dengan berat molekul 41 kD untuk sub unit α dan 38 kD untuk sub unit β.

Teknik Purifikasi atau pemurnian

pemurnian enzim adalah mengisolasi enzim spesifikasi dan ekstra sel “Mentah” (crude) yang mengandung banyak komponen lain. Teknik pemurnian yang dilakukan pada enzim Luciferase pada Bakteri Photobacterium Phosphoreum menggunakan kolom dietilaminoetil cellulosa (DEAE cellulosa) ukuran 2x45cm yang diregenerasi dengan 200 ml larutan NaCl pada konsentrasi 2M. kemudian DEAE cellulosa dicuci dengan 2 liter air suling dingin dan disetimbangkan dengan 2 liter larutan buffer fosfat pada pH 7,0 dan konsentrasi 0,02 M. setelah itu ambil 10 ml sampel enzim Luciferase pada Bakteri Photobacterium Phosphoreum dimasukkan ke kolom dan kemudian dielusi yang fungsinya untuk mengikat enzim pada DEAE cellulose dengan larutan buffer fosfat. Kemudian enzim yang terikat pada kolom dielusi dengan gradien NaCl sebanyak 200 ml dengan konsentrasi 0,5 M dan ditampung dalam fraksi-fraksi dengan kecepatan 1 ml/menit. Untuk mengetahui fraksi-fraksi yang terkandung dalam enzim dapat dilakukan pengukuran serapannya pada panjang gelombang 280 nm, kemudian diuji aktivitas dan konsentrasinya. Apabila fraksi-fraksi ada aktivitasnya kemudian dipekatkan dengan ammonium ulfat pada 40-75 % saturasi. Dalam hal ini juga didapatkan pemurnian tingkat tinggi yang dapat menggunakan gel filtrasi kromatografi Shepadex G-100, seimbangkan dengan 0,35 buffer fosfat pda pH 7. Dan lakukan hal yang sama pada pemurnian di atas.

Dalam pengukuran aktivitas biolumunisensi dilakukan pada kondisi pada 25 0C dimana FMNH2 harus diinjeksi secara cepat. Setiap fraksi-fraksi enzim seperti ekstrak kasar, fraksionasi pada 25-85% saturasi, DEAE cellulosa, gel filtrasi, diuji aktivitasnya sesuai langkah-langkah yang telah dijelaskan. Konsentrasi protein diuji menggunakan metode Lowry, dengan bantuan bovine serum albumin (BSA) sebagai standar. Absorbansi pada 750 nm digunakan sebagai dasar pengujian konsentrasi protein. Untuk mengetahui tingkat kemurnian enzim setelah pemurnian, maka dilakukan elektroforesis Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE). Hasil dari proses pemurnian tersebut menunjukan peningkatan kemurnian terhadap ekstrak kasar sebanyak 1616 kali.

Karakterisasi sifat enzim

Karakterisasi sifat-sifat fisika dari Luciferase pada Bakteri Photobacterium Phosphoreum dilakukan dengan mengukur spektrum serapan (eksitasi) dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis dan spektrum pemancaran cahaya dengan menggunakan spektrofotometer fluorosensi model F-2000.

Kesimpulan

Reaksi bioluminisensi terjadi akibat enzim Luciferase pada bakteri Photobacterium Phosphoreum yang diisolasi dari cumi-cumi Jepara Indonesia mengikat substrat-substratnya yaitu FMNH2, O2, dan RCOH. Enzim Luciferase pada bakteri Photobacterium Phosphoreum terdiri dari dua sub unit α dan β dengan berat molekul 41 kD dan 38 kD.